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Abstrait

La dérégulation neurochimique sous-tend de nombreuses pathologies et peut être surveillée en mesurant la composition du liquide interstitiel cérébral (ISF). Les outils in vivo existants pour l’échantillonnage d’ISF ne permettent pas de mesurer de grosses molécules rares, telles que les protéines et les neuropeptides, et ne peuvent donc pas générer une image complète du connectome neurochimique. Notre plateforme micro-invasive, composée d’une pompe nanofluidique couplée à une sonde sans membrane, permet d’échantillonner plusieurs biomarqueurs neuronaux en parallèle. Cette plate-forme surpasse l’état de l’art des pompes à faible débit en offrant un contrôle de faible volume (volumes à une seule course, <3 nl) et un débit de fluide bidirectionnel (<100 nl / min) avec un volume mort négligeable (<30 nl) et a été validé in vitro, ex vivo et in vivo chez les rongeurs. Les échantillons ISF (<1,5 μL) peuvent être traités par chromatographie liquide-spectrométrie de masse en tandem. Ces biopsies liquides sans étiquette du cerveau pourraient permettre une compréhension plus approfondie de l'apparition, du mécanisme et de la progression de diverses pathologies neuronales.

INTRODUCTION

La pathologie neurale est caractérisée par une dérégulation électrique et chimique dans des circuits cérébraux distincts, et une gamme de techniques a été développée pour étudier ces signaux in vivo dans des états physiologiques et pathologiques (1, 2). Les outils de mesure et de modulation de la signalisation électrique, tels que les microélectrodes implantées, ont généré une compréhension plus approfondie de la dynamique des réseaux neuronaux (36). Cependant, ils ne représentent pas pleinement la complexité de la signalisation in vivo car ils ne détectent que des analytes actifs redox. Les outils existants ne peuvent donc pas former une carte spatiale et neuroanatomique du connectome neurochimique complet, les neurochimiques du cerveau sous-tendant le traitement des informations motrices, sensorielles et cognitives (7). Des techniques telles que la microdialyse, les biocapteurs cellulaires et les transistors à effet de champ fonctionnalisés par aptamère surmontent cette limitation en permettant l’échantillonnage in vivo de substances neurochimiques électroneutrales (8dix). Ces outils ont fourni des informations précieuses sur la composition, la concentration et la distribution in vivo de petits neurotransmetteurs largement répandus tels que l’acide y-aminobutyrique (GABA), le glutamate, l’acétylcholine et la sérotonine. La pièce manquante dans la cartographie du connectome neurochimique est un outil de surveillance micro-invasive de neurochimiques plus grands et plus rares, tels que les neuropeptides et les protéines (1114).

L’adaptation de la méthode d’échantillonnage neurochimique la plus couramment utilisée, la microdialyse, pour répondre à cette application est peu pratique et indésirable pour plusieurs raisons. La microdialyse repose sur la collecte de substances neurochimiques du liquide interstitiel (ISF) par diffusion à travers une membrane semi-perméable (8, 15, 16). La perte d’extraction à travers la membrane semi-perméable limite la concentration mesurable de neurochimiques de l’espace interstitiel (8). Les fractions de récupération peuvent être améliorées en diminuant le débit, mais cela augmente le temps d’échantillonnage, diminuant ainsi la masse totale de substances neurochimiques collectées et le volume total d’échantillon collecté. L’augmentation de la longueur de la membrane peut également améliorer la fraction de récupération, mais cela réduit la résolution spatiale de l’échantillonnage à partir d’un nœud neural spécifique. La grande taille de certains neurochimiques tels que les neuropeptides et les protéines, et leur propension à une absorption non spécifique vers les membranes, motivent l’augmentation de la taille des pores de la membrane, mais cela peut entraîner une fuite de liquide de perfusion dans les tissus environnants (1719). Les membranes suppriment également la capacité de mesurer le contenu des vésicules extracellulaires à noyau dense, qui transportent des protéines et des acides nucléiques et jouent un rôle important dans la signalisation cellule-cellule dans le cerveau (20). De plus, les grandes tailles des sondes de microdialyse (150 à 400 μm) limitent la résolution spatiale et endommagent l’architecture délicate du cerveau, entraînant une défaillance de la sonde due à des cicatrices tissulaires et rendant la technique incompatible avec les études longitudinales du connectome neurochimique (19, 21, 22). L’échantillonnage in vivo micro-invasif et sans membrane de grands biomarqueurs neuronaux rares dans l’ISF en parallèle est donc un besoin critique non satisfait en neurosciences (17). Pour répondre à ce besoin, il faudra développer une plate-forme d’échantillonnage capable d’extraire de petits volumes d’ISF du cerveau à l’aide d’une sonde micro-invasive ne nécessitant pas de membrane. Nous avons conçu une plateforme qui répond à ces exigences et démontre sa capacité à effectuer un échantillonnage aigu de grandes protéines neurales in vivo.

RÉSULTATS

Conception et fabrication de pompe nanofluidique activée au nitinol

Nous avons construit une plate-forme d’échantillonnage micro-invasive sans membrane pour extraire directement de petits volumes d’ISF à partir de nœuds neuronaux distincts et démontré la capacité d’identifier et de quantifier un large éventail de substances neurochimiques dans les échantillons extraits. La plateforme est composée d’une pompe péristaltique nanofluidique personnalisée (nanopompe) couplée à une sonde micro-invasive sans membrane. La nanopompe est composée de fils thermosensibles, fabriqués en alliage à mémoire de forme nitinol, et enroulés autour de tubes de styrène éthylène butylène styrène (SEBS) fabriqués sur mesure (Fig. 1A). Les fils subissent une transition de phase lorsqu’ils sont chauffés à 70 ° C, accomplie en faisant passer un courant à travers le fil et en entraînant un chauffage ohmique en raison de la résistance électrique élevée de l’alliage. Le chauffage entraîne une contraction physique des fils jusqu’à 5% de leur longueur d’origine et déplace le fluide dans le tube SEBS. L’élimination du courant entraîne un refroidissement qui détend le fil et la tubulure. La contraction séquentielle des actionneurs de nitinol entraîne l’écoulement du fluide péristaltique, la direction d’écoulement dépendant de la séquence de contraction du fil.

Fig. 1 Conception et caractérisation d’une pompe nanofluidique activée au nitinol.

(UNE) En haut: Schéma du pompage péristaltique à fil de nitinol. Milieu: déformation du tube (diamètre extérieur 1 mm, diamètre intérieur 0,5 mm) en réponse à la contraction du fil de nitinol (n = 3). Longueur du fil = 14,6 mm. Diamètre du fil = 100 μm. En bas: images du pompage péristaltique à fil de nitinol. L’écoulement dans une direction est entraîné par la contraction séquentielle des fils dans cette direction. Barres d’échelle, 2 mm. (B) Fluide déplacé en fonction du temps en réponse à une contraction séquentielle des fils avec un chevauchement de 500 ms entre les fils. Le manque de chevauchement entre les quatrième et premier fils entre les cycles entraîne un reflux. (C) Le débit de fluide est influencé par la précontrainte du fil (n = 3), le pourcentage de sa largeur d’origine auquel le tube est comprimé. De petites valeurs de pré-tension garantissent que les fils ne glissent pas le long de la tubulure entre les cycles de contraction-relaxation, augmentant l’efficacité du flux, tandis que de grandes valeurs de pré-tension contractent la lumière du tube et réduisent le débit. () Le débit de fluide est réduit à des valeurs proportionnelles à l’utilisation in vivo (75,9 nl / min, 1,5 nl de reflux par cycle de pompage) en utilisant un tube fabriqué sur mesure (1 mm de diamètre extérieur, 0,1 mm de diamètre intérieur). (E) L’efficacité du débit de fluide augmente avec le nombre croissant de fils d’actionneur, avec des débits et des SD correspondant à nos exigences de conception pour un débit entraîné par quatre fils (n = 3).

Le débit de la nanopompe peut être réglé via une gamme de paramètres de conception. Des études initiales avec des tubes SEBS achetés dans le commerce (1 mm de diamètre extérieur, 0,5 mm de diamètre intérieur) ont démontré un contrôle de flux directionnel (Fig.1B), mais les débits résultants étaient trop rapides pour être utilisés à l’intérieur du cerveau, ce qui nécessite des débits <100 nl / min (3). L’efficacité du cycle d’écoulement était également atténuée par le reflux dans la tubulure entre les cycles de pompage suivants, car cela réduisait le volume net d’écoulement de fluide directionnel par cycle. Plusieurs paramètres contrôlent les performances de la nanopompe, notamment le temps d’activation de l’actionneur, le temps d’arrêt de l’actionneur, le temps de chevauchement entre les actionneurs et le temps de chevauchement entre les cycles. Ces paramètres ont été optimisés pour choisir le débit le plus élevé, indiquant un cycle d’écoulement plus efficace avec un reflux réduit (fig. S1). Il a également été démontré que la pré-tension du fil de nitinol affectait les performances de la nanopompe. La pré-tension était définie comme le degré auquel le tube était comprimé lorsqu’un fil de nitinol individuel était dans son état non contracté. Les fils avec une pré-tension de 0% décalés le long de la longueur du tube pendant la contraction et le refroidissement, réduisant l’efficacité et la reproductibilité du flux de fluide et augmentant le reflux. Des degrés beaucoup plus élevés de pré-tension resserrent le canal interne du tube, réduisant le volume de course de fluide en réponse à la contraction de l’actionneur et diminuant ainsi le débit résultant. Des pré-tensions entre 5 et 15% ont été montrées pour maximiser l’efficacité d’écoulement (Fig. 1C). Des tubes SEBS fabriqués sur mesure de diamètre intérieur réduit (100 μm) ont été fabriqués pour permettre un contrôle nanofluidique plus précis et cibler les débits inférieurs requis pour les applications in vivo. Cela a réduit les débits directionnels à des valeurs proportionnelles aux tests dans les tissus cérébraux et a entraîné un reflux négligeable (Fig. 1D). La variation du nombre de fils d’actionneur a confirmé que des débits d’environ 50 à 100 nl / min (0,83 à 1,7 nl / s) pouvaient être obtenus avec trois fils ou plus (Fig. 1E). Des pompes fonctionnant avec quatre fils ont été utilisées pour toutes les expériences suivantes.

Un capillaire en borosilicate à une seule lumière (80 μm de diamètre extérieur, 50 μm de diamètre intérieur) est inséré directement dans le tube de la pompe (1 mm de diamètre extérieur, 100 μm de diamètre intérieur) sans connecteurs d’interface, comme requis pour les pompes à seringues traditionnelles, réduisant ainsi considérablement la mort de la pompe à <30 nl, contre ~ 1 à 3 μl pour les systèmes à base de seringues. Ces sondes micro-invasives peuvent être directement insérées et orientées dans le cerveau et présentent une cicatrisation gliale beaucoup moins chronique après 8 semaines par rapport aux dispositifs de plus grand diamètre (≥150 μm) (23). De plus, de petites lumières de cette taille empêchent l’entrée de gros débris et ne bouchent pas (24). Cela supprime le besoin d’une membrane lorsque les sondes sont implantées à long terme. La nanopompe peut conduire le fluide dans les deux modes de perfusion et d’échantillonnage à travers les sondes, avec des débits similaires dans les deux directions (Fig. 2, A et B). Le débit est déterminé par le diamètre intérieur de la sonde avec des diamètres croissants correspondant à des débits croissants (Fig. 2C). La plate-forme d’échantillonnage nanofluidique conserve la fonctionnalité des fantômes cérébraux en gel d’agarose, qui sont couramment utilisés pour la caractérisation in vitro des implants neuraux car ils imitent les propriétés mécaniques du tissu cérébral (3, 9, 23). La perfusion push-pull réalisée dans des gels d’agarose a démontré que l’infusion de colorant bleu dans des gels colorés en jaune entraînait l’extraction d’échantillons colorés en vert, générés par un mélange de fluide entre les colorants bleu et jaune (Fig.2, D et E, et fig.S2) . Le débit d’échantillonnage dans les gels d’agarose est inférieur au débit de perfusion pour les mêmes paramètres de contrôle de débit, et ce comportement est attribué à la résistance fluidique générée par l’hydrogel par rapport à l’air. Des débits de fluide <100 nl / min ont été ciblés, car ils étaient auparavant considérés comme sûrs pour une utilisation in vivo (3).

Fig. 2 Infusion et prélèvement pilotés par nanopompe via une sonde neuronale micro-invasive.

(UNE) Suivi du déplacement de fluide d’une perfusion entraînée par nanopompe à travers un capillaire en borosilicate (diamètre extérieur 80 μm, diamètre intérieur 50 μm). (B) Suivi du déplacement de fluide de l’échantillonnage entraîné par nanopompe à travers un capillaire en borosilicate (diamètre extérieur 80 μm, diamètre intérieur 50 μm). (C) Débit de perfusion en fonction du diamètre intérieur du capillaire en borosilicate (n = 3 par groupe). () Suivi du déplacement de fluide d’une perfusion entraînée par nanopompe à travers un capillaire de borosilicate (80 μm de diamètre extérieur, 50 μm de diamètre intérieur) dans un fantôme de cerveau en gel d’agarose. (E) Suivi du déplacement de fluide de l’échantillonnage entraîné par nanopompe à travers un capillaire en borosilicate (80 μm de diamètre extérieur, 50 μm de diamètre intérieur) à partir d’un fantôme cérébral en gel d’agarose. L’échantillonnage a été effectué après la perfusion.

Cette conception simple de pompe et de sonde à deux composants permet une perfusion push-pull à faible débit à partir d’une seule lumière avec un volume mort négligeable, offrant un avantage significatif par rapport aux techniques d’échantillonnage neurochimique précédentes qui reposent sur des sondes à double lumière beaucoup plus grandes couplées à des pompes à seringues. avec des volumes morts de microlitre (25, 26). La plate-forme d’échantillonnage nanofluidique offre une sécurité et une efficacité améliorées par rapport à ces plates-formes car elle réduit la taille des sondes insérées et le volume d’ISF qui doit être prélevé pour effectuer une biopsie liquide du cerveau. La nouvelle conception de la pompe offre également à la fois un contrôle précis de faible volume (volumes à une seule course, <3 nl) et un débit de fluide bidirectionnel, des capacités non démontrées par d'autres pompes à faible débit contrôlées par du nitinol ou d'autres actionneurs (2730). Ces avantages par rapport à l’état de l’art motivé, optimisent davantage la plate-forme d’échantillonnage pour une utilisation in vivo.

Miniaturisation, optimisation et benchmarking de la plateforme d’échantillonnage nanofluidique

Le prototype de paillasse de notre nanopompe a été réduit à une taille portable pour une utilisation in vivo en alimentant les fils avec une batterie et en contrôlant leur contraction séquentielle avec un microcontrôleur (Fig. 3A et Fig. S3). La consommation électrique de la pompe et la durée de fonctionnement de la batterie ont été caractérisées en fonction du diamètre et de la longueur du fil (fig. S4). Cela a confirmé que ni le temps de fonctionnement de la batterie ni la rupture de fil induite par la fatigue n’étaient un facteur limitant pour les expériences in vivo, car ils dépassaient de loin le temps d’échantillonnage requis estimé (≤ 30 min).

Fig. 3 Miniaturisation, optimisation et benchmarking de la plateforme d’échantillonnage nanofluidique.

(UNE) Schéma de la conception d’une nanopompe portable, convertissant le prototype de paillasse en un dispositif portable alimenté par batterie, permettant ainsi une utilisation in vivo. Photographie d’une nanopompe portable fabriquée sur la fig. S3. PCB, carte de circuit imprimé. (B) Le fluide déplacé en fonction du temps dépend du fait que les fils de nitinol fonctionnent sur des tubes remplis d’air ambiant (essais 1, 2 et 3) ou d’eau (essais 1, 2 et 3). (C) Fluide déplacé en fonction du temps pour différents degrés de chevauchement (150 à 1000 ms) entre les fils pendant la contraction séquentielle. () Fluide déplacé en fonction du temps pour un code de contrôle de débit optimisé pendant la perfusion et l’échantillonnage à partir d’un capillaire en borosilicate (diamètre extérieur 80 μm, diamètre intérieur 50 μm). Les données de trois essais distincts sont présentées pour la perfusion et l’échantillonnage. (E) Contenu en MBP (~ 13 à 21 kDa) dans les échantillons extraits à l’aide d’une plate-forme de nanopompe et d’une plate-forme de microdialyse standard et comparés à un contrôle de concentration connue. L’échantillon extrait par nanopompe surpasse considérablement la microdialyse dans la mesure de cette molécule, car il évite la perte d’extraction d’échantillon à travers une membrane. Les échantillons ont été mesurés à l’aide d’un spectrophotomètre. * représente l’analyse de la variance (ANOVA) test de Tukey post hoc, P ≤ 0,05. ** représente le test de Tukey post hoc ANOVA, P ≤ 0,01. (F) Teneur en hémoglobine (~ 64,5 kDa) dans les échantillons extraits à l’aide d’une plate-forme de nanopompe et d’une plate-forme de microdialyse standard et comparée à un contrôle de concentration connue. L’échantillon extrait par nanopompe n’est pas significativement différent du contrôle et surpasse considérablement la microdialyse dans la mesure de cette molécule, car il évite la perte d’extraction de l’échantillon à travers une membrane. n.s. représente le test de Tukey post hoc ANOVA P > 0,05. **** représente le test Tukey post hoc ANOVA P ≤ 0,0001.

Le débit de fluide et la variabilité entre les essais dépendent du fait que le tube sous le fil est rempli de liquide, avec des résultats plus cohérents observés dans les tubes remplis (Fig. 3B). Le temps de chevauchement entre la contraction séquentielle du fil a été varié pour identifier l’effet sur le débit, et un code de contrôle de débit qui maintenait à la fois les taux de perfusion et d’échantillonnage en dessous de 100 nl / min a été choisi pour les expériences suivantes (Fig. 3, C et D). La cohérence du débit entre les essais a servi à confirmer que les performances in vivo seraient probablement maintenues dans une plage étroitement contrôlée et prédéterminée.

L’élévation de la sonde par rapport aux actionneurs de nitinol n’a entraîné aucune différence observable de débit, indiquant que la pompe pouvait pomper de manière fiable contre un gradient de hauteur (fig. S5A). L’augmentation de la distance entre la sonde et les actionneurs de nitinol n’a pas non plus affecté de manière significative le débit, mais comme des distances plus longues semblaient augmenter la variation du débit entre les essais, des distances ≤ 100 mm ont été utilisées dans les expériences suivantes (fig. S5B). Des démonstrations précédentes ont montré que les sondes peuvent être implantées de manière chronique dans le cerveau de rongeurs et conservent la fonctionnalité fluidique jusqu’à 1 an après l’implantation (24). Pour tester si la pompe pouvait être facilement détachée et rattachée à une sonde implantée de manière chronique, nous avons conçu un connecteur amovible, composé d’une aiguille de calibre 30 (G) liée à un tube en polyétheréthercétone (PEEK). Ce connecteur a conservé la fonctionnalité fluidique tout en diminuant le débit à travers la sonde, mais cela peut être facilement réglé en modifiant le temps de chevauchement des fils (fig. S5C). Le connecteur pourrait être utilisé, à l’avenir, pour la collecte d’échantillons d’ISF chronique à partir d’un seul endroit dans le cerveau grâce à une sonde implantée en attachant et détachant simplement la nanopompe à différents moments (fig. S5D).

Une comparaison in vitro de la plate-forme sans membrane et d’une configuration de microdialyse standard a été réalisée en utilisant les deux outils pour mesurer des échantillons fluidiques de concentration et de composition chimiques connues. Des échantillons assortis de temps provenant d’une perfusion push-pull (perfusion de 10 min, retrait de 20 min) réalisée avec la plate-forme à nanopompe, ainsi que des échantillons prélevés à partir d’une perfusion de microdialyse de 30 min, ont été analysés pour la teneur totale en protéines en utilisant soit un spectrophotomètre ou par chromatographie liquide – spectrométrie de masse en tandem (LC-MS / MS). Les deux techniques d’échantillonnage ont démontré des capacités similaires pour échantillonner avec précision la substance P (1347,63 Da), par rapport l’une à l’autre et à un contrôle (fig. S5E). Cependant, la plate-forme de nanopompes a considérablement surpassé la microdialyse dans sa capacité à mesurer les plus grosses molécules, la protéine basique de myéline (MBP; ~ 13 à 21 kDa) et l’hémoglobine (64 458 Da) (Fig.3, E et F). Il a démontré une perte d’extraction minimale de MBP, mesurant des concentrations moyennes d’échantillon de 67,4% de la solution mère témoin, par opposition à la microdialyse, qui ne mesurait que 20,0% du témoin. De même, la nanopompe a démontré une perte d’extraction minimale d’hémoglobine, mesurant des concentrations moyennes d’échantillon de 86,8% de la solution mère de contrôle, par opposition à la microdialyse, qui ne mesurait que 7,3% du contrôle. Cela a confirmé l’hypothèse selon laquelle cet outil micro-invasif sans membrane est particulièrement adapté à la mesure de grands neurochimiques rares, car il limite la perte d’extraction de ces biomarqueurs à travers les membranes.

Caractérisation ex vivo de la plateforme d’échantillonnage nanofluidique

La plate-forme nanofluidique peut être utilisée pour infuser du liquide dans et échantillonner du liquide à partir de tissu cérébral ex vivo en plus des fantômes cérébraux en gel d’agarose. La plate-forme d’échantillonnage peut être directement interfacée avec les régions cérébrales d’intérêt via la sonde de borosilicate sans l’utilisation d’un tube de guidage (Fig. 4, A et B). Cela permet une administration fluidique avec moins de dommages aux tissus environnants en réduisant l’empreinte spatiale de l’appareil (23). La capacité de la pompe à délivrer de petits volumes à des débits de perfusion inférieurs au seuil de sécurité de 100 nl / min à des tissus cérébraux de rat ex vivo a été évaluée. Les sondes en borosilicate ont été abaissées de 5 mm de la surface dorsale d’un cerveau ex vivo pour cibler les structures profondes. Le colorant a été chargé dans la nanopompe et infusé à travers les sondes dans un cerveau ex vivo pendant 1 min à 95 nl / min. L’histologie a démontré une administration de bolus réussie dans le cerveau (Fig. 4C). Un colorant fluorescent infusé pendant 30 s dans l’hémisphère droit et 60 s dans l’hémisphère gauche d’un cerveau ex vivo, imagé à l’aide d’un système d’imagerie in vivo fluorescent (IVIS), a démontré une augmentation proportionnelle de la taille du bolus (telle que quantifiée par l’efficacité radiante) , avec un délai de livraison plus long (Fig. 4D). Une série d’images fluorescentes ont été obtenues toutes les 6 s au cours d’une perfusion continue pour mieux caractériser cette relation, démontrant que l’efficacité radiante augmentait linéairement avec le temps d’infusion (Fig. 4E et Fig. S6B). Ceci a corroboré les résultats obtenus avec les études de perfusion de gel d’agarose précédentes. Ces résultats valident la capacité de la plate-forme à effectuer une perfusion cohérente à faible volume dans les structures cérébrales profondes à de faibles débits.

Fig. 4 Caractérisation ex vivo de la plateforme d’échantillonnage nanofluidique.

(UNE) Schéma de la plate-forme d’échantillonnage en interface avec le cerveau de rongeurs pour collecter des échantillons d’ISF. Cette méthodologie pourrait potentiellement être adaptée pour l’échantillonnage chronique (fig. S5D). (B) Image au microscope électronique à balayage du capillaire en borosilicate. (C) Coupe histologique de cerveau de rongeur montrant une infusion de bleu trypan dans un tissu ex vivo. () Imagerie fluorescente du cerveau ex vivo montrant un contrôle de volume de bolus de colorant Genhance 750 en fonction du temps de perfusion (30 s hémisphère droit, 60 s hémisphère gauche). Barre d’échelle, 2 cm. (E) Imagerie time-lapse (à gauche) du volume du bolus de colorant fluorescent dans le cerveau ex vivo montrant une augmentation linéaire (à droite) du volume en fonction du temps de perfusion. Barre d’échelle, 2 cm. Les données de deux perfusions supplémentaires sont présentées à la fig. S6B.

Caractérisation in vivo de la plateforme d’échantillonnage nanofluidique

La modalité d’échantillonnage du système a été caractérisée de manière aiguë in vivo. Suite à une craniotomie, une sonde directement interfacée avec la pompe a été implantée pour cibler la substantia nigra du rat (fig. S6C). Le liquide céphalo-rachidien artificiel (aCSF) a été perfusé dans le tissu pendant 10 min (95 nl / min) suivi d’une période de retrait de 20 min (65 nl / min). L’ISF échantillonné a été analysé via LC-MS / MS. Les protocoles de traitement ont été optimisés pour la protéomique plutôt que pour la détection de petites molécules. Suite à une digestion à la trypsine, des protéines abondantes dans le cerveau du rat ont été identifiées pour démontrer la preuve de l’échantillonnage ISF.

Un total de 96 protéines ont été identifiées dans notre premier échantillon in vivo. Les protéines ont été identifiées à l’aide d’un moteur de recherche de logiciel MS (Mascot) qui utilise un algorithme pour évaluer la probabilité d’un spectre MS / MS correspondant à un peptide donné à partir d’une base de données. Parmi les protéines identifiées, la MBP (~ 13 à 21 kDa), la protéine 1 soluble dans l’acide cérébral (BASP-1; ~ 22 kDa) et la γ-énolase (~ 39 kDa) étaient d’un intérêt particulier (Fig.5), comme ils sont connus pour être observés dans le LCR sain, et leurs concentrations changent en cas de maladie neurologique (31, 32). Les outils précédemment utilisés pour quantifier les substances biochimiques dans l’ISF neuronal ont généré des informations sur des molécules beaucoup plus petites par comparaison, telles que le GABA (~ 100 Da), le glutamate (~ 150 Da), l’acétylcholine (~ 150 Da) et la sérotonine (~ 180 Da). Ces résultats démontrent ainsi la capacité supérieure de notre plateforme micro-invasive à échantillonner des protéines comme biomarqueurs traçables dans le cerveau in vivo. L’ajustement du temps d’échantillonnage et le développement de protocoles robustes et optimisés d’isolement des protéines permettront la collecte et la détection de protéines et de peptides moins abondants dans les travaux futurs (fig. S6D).

Fig. 5 Caractérisation biochimique d’échantillons in vivo de l’ISF neurale.

(UNE) Spectre MS / MS identifiant MBP dans un échantillon in vivo. (B) Spectre MS / MS identifiant BASP-1 dans un échantillon in vivo. (C) Spectre MS / MS identifiant la γ-énolase dans un échantillon in vivo. Les ions fragments identifiés dans le spectre MS / MS sont marqués, avec des ions fragments de type b contenant l’extrémité N et des ions fragments de type y contenant l’extrémité C.

L’exécution d’un échantillonnage ISF in vivo piloté par nanopompe de la substance noire chez deux rats supplémentaires a révélé que cette méthode était robuste et reproductible. Sur les 136 peptides identifiés, 77 (56,7% du total) se chevauchaient avec un autre réplicat biologique, tandis que 28 (20,6% du total) ont été détectés dans tous les réplicats (figure 6 et tableau S1). Parmi les protéines identifiées dans les trois échantillons figuraient la transthyrétine (~ 14 kDa), que l’on pense être produite dans le plexus choroïde et observée à des niveaux plus élevés dans le tissu cérébral et le LCR, et la protéine 15 de type kinésine (~ 160 kDa), une enzyme motrice. le plus associé à la croissance et au maintien des axones (33, 34). La variance entre les protéines échantillonnées à partir de répliques biologiques pourrait être expliquée par l’analyse de la SEP dépendant des données et l’hétérogénéité du cerveau. La variabilité de la transcription, de la traduction et de l’expression des protéines entre les régions cérébrales et les types de cellules est bien documentée (35, 36). Des différences minimes dans le placement de la sonde par rapport à la physiologie unique d’un animal pourraient positionner la sonde près de différentes cellules, affectant le contenu de petits volumes d’ISF capturés par la plate-forme d’échantillonnage. De plus, la variance introduite par la chirurgie, y compris le traumatisme associé au placement de la sonde, peut également expliquer l’hétérogénéité de l’échantillon.

Fig. 6 Comparaison des profils biochimiques d’échantillons in vivo de l’ISF neurale. Milieu:

Diagramme de Venn affichant le nombre de protéines identifiées dans chacun des trois échantillons in vivo de la substance noire du rat extraite à l’aide de la nanopompe. Haut: Spectre MS / MS identifiant la transthyrétine, trouvé dans tous les échantillons in vivo. Bas: Spectre MS / MS identifiant la protéine 15 de type kinésine, trouvée dans tous les échantillons in vivo. Les ions fragments identifiés dans le spectre MS / MS sont marqués, avec des ions fragments de type b contenant l’extrémité N et des ions fragments de type y contenant l’extrémité C. [M + 2H]2+ désigne un ion précurseur.

DISCUSSION

Les troubles neurologiques sont caractérisés par une dérégulation électrique et biochimique dans des régions cérébrales spécifiques. Les outils existants pour caractériser dynamiquement la dysrégulation biochimique in vivo ne permettent pas l’identification quantitative et parallèle de tous les biomarqueurs présents dans l’ISF, en particulier les neurochimiques rares à longue chaîne et le contenu des vésicules extracellulaires à noyau dense. Le suivi de ces molécules nécessite de sacrifier des sujets à partir de modèles animaux de maladie et d’effectuer une coloration immunohistochimique sur des tranches de tissu. Ces techniques sont souvent non spécifiques et reposent sur des procédures chirurgicales terminales et sont donc incapables de suivre les fluctuations dynamiques de gros neurochimiques rares au fil du temps chez un seul animal.

La conception sans membrane de notre plate-forme permet des «biopsies liquides» dynamiques, quantitatives et sans étiquette de régions cérébrales ciblées en échantillonnant directement l’ISF à partir de nœuds neuronaux distincts et en traitant l’échantillon à l’aide de techniques analytiques LC-MS / MS. Les empreintes spatiales des sondes micro-invasives sont nettement plus petites que les sondes traditionnelles utilisées pour l’échantillonnage chimique, telles que les sondes de microdialyse, ce qui se traduit à la fois par une résolution spatiale accrue et une réduction de l’inflammation des tissus environnants (23, 3739). La réalisation d’une perfusion push-pull à travers ces sondes à lumière unique, avec un volume mort négligeable et un contrôle de faible débit, est rendue possible par la conception unique de notre nanopompe bidirectionnelle et ne peut pas être réalisée avec d’autres plates-formes déjà conçues ou disponibles dans le commerce. Les échantillons aigus d’ISF obtenus à l’aide de notre appareil sans membrane démontrent la capacité de détecter de grandes protéines qui ne peuvent pas être échantillonnées à l’aide de techniques à base de membrane. Laisser la sonde implantée de manière chronique et brancher la nanopompe si nécessaire pourrait également permettre un échantillonnage longitudinal à partir d’un seul nœud neuronal à l’avenir.

La plate-forme de nanopompes est capable d’extraire des informations biochimiques significatives à partir d’échantillons ISF <1,5 μl en volume avec la capacité d'ajuster facilement la résolution temporelle et pourrait fournir un aperçu sans précédent de la composition de l'ISF in vivo. Cette plateforme pourrait être utilisée à l'avenir pour générer de nouvelles connaissances fondamentales sur les niveaux d'expression des biomarqueurs dans des modèles animaux bien établis de maladies humaines. Cela a le potentiel de permettre un diagnostic plus précis des troubles neurologiques débilitants chez l'homme. Il pourrait également être utilisé pour aider à identifier de nouvelles cibles biochimiques pour les thérapies neurologiques expérimentales. La plate-forme d'échantillonnage nanofluidique pourrait aider à relever le défi technique critique limitant la capacité de mesurer le connectome neurochimique complet. Nous espérons qu'il sera utilisé pour approfondir la compréhension neuroscientifique de l'apparition, de la progression et du traitement des maladies neuronales.

MÉTHODES

Conception et caractérisation de la pompe

L’unité fonctionnelle de la pompe se compose de deux composants de base: une tubulure SEBS pouvant s’interfacer avec des microsondes implantables et des fils d’actionneur en alliage à mémoire de forme thermosensibles. Un tube extrait d’une pompe implantable iPrecio (1 mm de diamètre extérieur, 500 μm de diamètre intérieur) a été utilisé pour les expériences initiales, et un tube fabriqué sur mesure (Apollo Medical Extrusion Technologies) de dimensions 1 mm de diamètre extérieur et 100 μm de diamètre intérieur a été utilisé pour expériences de caractérisation in vitro, ex vivo et in vivo. Enroulés autour du tube se trouvent quatre fils composés du matériau à mémoire de forme en alliage nickel-titane, nitinol (Flexinol, RobotShop). Des fils de 37, 50 et 100 µm de diamètre ont été utilisés, et tous ont subi une transition d’une phase martensite à une phase austénitique à 70 ° C. Le courant passé à travers le fil entraîne un chauffage ohmique en raison de la résistance électrique élevée de l’alliage, ce qui entraîne une contraction physique du fil (jusqu’à 5% de la longueur d’origine) qui déplace le fluide dans le tube SEBS. Le courant nécessaire pour chauffer le fil et le temps nécessaire pour refroidir le fil dépendent du diamètre du fil et ont été bien caractérisés par le fabricant. Le déplacement du fil a été surveillé et enregistré avec un microscope optique et traité via le logiciel ImageJ (National Institutes of Health) (40).

Des capillaires en borosilicate (diamètre externe de 60 à 170 μm, diamètre interne de 20 à 100 μm, VitroCom Inc.) ont été insérés dans le tube SEBS et scellés en place à l’aide d’un époxy durcissable à la lumière ultraviolette (Loctite 4305, Henkel Corp). Pour les conceptions intégrant des connecteurs amovibles, les capillaires ont été scellés dans un tube PEEK (1,59 mm de diamètre extérieur, 250 μm de diamètre intérieur, IDEX Health & Science), et une aiguille 30G (Atlantic Medical Supply) a été ajustée à la fois dans le PEEK et le SEBS tubes. L’écoulement de fluide à travers le tube et la sonde est entraîné par la contraction séquentielle des fils de nitinol en série, avec le nombre et la pré-tension des fils d’actionneur, le temps chauffé, le temps refroidi et le chevauchement entre les fils servant de paramètres de conception réglables. Les algorithmes de contrôle de flux ont été classés sur la base de l’efficacité du flux, les codes minimisant le reflux étant préférés. L’électronique de contrôle de paillasse a été formatée en une carte de circuit imprimé fabriquée sur mesure (Advanced Circuits) contrôlée par un Arduino Uno et alimentée par des piles 9 V (Energizer L522) pour la version miniaturisée portable de la pompe. Toutes les unités fonctionnelles de la pompe étaient enfermées dans un boîtier personnalisé imprimé en trois dimensions.

Le débit dans le tube SEBS a été surveillé et enregistré avec un microscope optique et traité via le logiciel ImageJ (National Institutes of Health) (40). Le ménisque de fluide a été suivi dans le temps et la géométrie connue de la lumière interne du tube a été utilisée pour calculer le volume de fluide déplacé en fonction du temps. Des tests in vitro en préparation pour des études ex vivo et in vivo ont été menés sur des fantômes cérébraux en gel d’agarose, préparés en mélangeant de l’agarose (MilliporeSigma) avec de l’eau désionisée (DI) à une concentration de 0,6% en poids à 80 ° C jusqu’à ce qu’un mélange limpide soit formé. Les gels ont été conservés à 4 ° C lorsqu’ils n’étaient pas utilisés.

Chirurgies et caractérisation ex vivo et in vivo

Des rats femelles Sprague-Dawley ont été achetés auprès des Charles River Laboratories et maintenus sous des cycles lumière / obscurité de 12 heures. For ex vivo experiments, animals were euthanized using carbon dioxide asphyxiation. Brains were extracted immediately following sacrifice and used in infusion and sampling trails. Infusate was composed of either aCSF or Trypan blue for examination via LC-MS/MS or histology, respectively. aCSF was made in-house following protocols developed in the Graybiel laboratory and contains 128 mM NaCl, 4 mM KCl, 1.7 mM CaCl2, 2.0 mM MgCl2, 2.0 mM sodium phosphate buffer, 0.8 mM NaH2PO4, and 0.1 mM glucose in DI water. Solution was titrated until a pH of 7.4 was met and sterilized using 0.2-μm syringe filters (nylon membrane, Pall Corporation). Trypan blue (0.4%; Sigma-Aldrich) was infused to visualize delivery to ex vivo tissue. Following infusion, brains were submerged in 10% formic acid (VWR) for 72 hours. Brains were then moved to increasing sucrose concentrations (Amresco Inc.). Tissue samples began immersion in 15% sucrose and were moved to 25% sucrose after 24 hours and left in 25% sucrose solution until they sank to the bottom of the container. The brain was then embedded in an optimal cutting temperature embedding medium (Sakura Finetek Inc.) and frozen via liquid nitrogen bath. Horizontal slices (15 μm) were obtained using a Leica CM1900 cryostat (Leica Biosystems Inc.), beginning on the dorsal surface descending the length of the tissue block. Slides were stored at −80°C until images could be taken using brightfield microscopy (EVOS Fl auto). Fluorescent dye infusion experiments were performed using the IVIS imaging system (PerkinElmer Inc.). Genhance 750 (0.05 mg/μl in 10× phosphate-buffered saline; PerkinElmer Inc.) was loaded into the sampling platform and infused into ex vivo brains or brain segments to demonstrate fluidic delivery into tissue. For static infusions, whole Sprague-Dawley brains were used with one infusion per hemisphere, and images were acquired for 2 s. In dynamic infusions, brain segments were used, and images were acquired every 6 s for a 60-s infusion.

Animals were anesthetized by inhalation of 3% isoflurane and maintained on 1 to 2% isoflurane throughout surgery for in vivo studies. Following anesthesia, animals were shaved and placed in a stereotaxic frame (Stoelting Co.). The shaved area was disinfected with alternating betadine and 70% ethanol swabs. Briefly, animals underwent a bilateral craniotomy. A midline incision was made to expose the skull. Two bilateral burr holes were made using a dental drill with a 1-mm drill bit (Meisinger GmbH) 5 mm posteriorly to bregma and 2 mm lateral to midline. The borosilicate capillary directly interfaced with the nanopump was lowered 8 mm from the brain surface, targeting the substantia nigra (SN), based on the Paxinos and Watson Rat Brain Atlas. Samples were withdrawn for 20 min following a 10-min infusion of sterile aCSF bilaterally. Animals were euthanized using carbon dioxide asphyxiation. All animal protocols were approved by the Massachusetts Institute of Technology Committee for Animal Care.

Sample storage and analysis

Samples obtained from in vivo and ex vivo sampling trials were stored in polypropylene microcentrifuge tubes (0.2 ml; VWR). Samples derived from ex vivo studies were immediately stored at −80°C. Samples taken during in vivo surgeries were stored in solid carbon dioxide until transferred to long-term storage at −80°C. Samples were processed within 1 week of storage.

Samples were thawed and denatured using 1% SDS (Sigma-Aldrich, 4509) for 1 hour at 95°C in preparation for analysis via LC-MS/MS. Acetonitrile (215 μl; Sigma-Aldrich, 34998) was added to each sample after cooling, and SDS was removed by a single-pot solid-phase–enhanced sample preparation (SP3) (GE Healthcare, 45152105050250 and Thermo Fisher Scientific, 65152105050250. Ten microliters of washed and equilibrated SP3 beads was added to each sample and incubated for 8 min. Supernatant was removed, and beads were rinsed three times with 100 μl of 80% acetonitrile. Residual acetonitrile was evaporated, and overnight on-bead proteolytic digestion was performed with trypsin (Promega, V5113) in 50 mM Hepes buffer (pH 8.5; Sigma-Aldrich, H3375). Sample was transferred to a fresh 1.5-ml tube and dried until a 10 μl of final volume was reached. One microliter of 10% acetic acid was added to the solution, and it was loaded onto a precolumn where it was washed with 0.1% acetic acid for 15 min before beginning analysis.

Peptide separation was carried out on an Agilent 1260 (Agilent Technologies) coupled to an Orbitrap Q-Exactive Plus (Thermo Fisher Scientific) for LC-MS/MS of trypsinized proteins. Peptides were loaded onto an analytical column with an integrated electrospray tip (1- to 2-μm orifice) following the wash step. Peptides were eluted with 70% acetonitrile in 0.2 M acetic acid (solvent B) in the following gradients: 0 to 30% solvent B in 8 min, 30 to 60% in 10 min, 60 to 100% in 5 min, and 100% for 5 min, before equilibrating back to solvent A. The flow was split to approximately 20 nl/min. The MS was operated in positive ion mode with a spray voltage of 2 kV and heated capillary temperature of 250°C. MS data were obtained in data-dependent acquisition mode. Full scans (MS1) were acquired in the mass/charge ratio (m/z) range of 350 to 2000 at a resolution of 70,000 (at m/z 200), with AGC (automatic gain control) target 3E6 and a maximum injection time of 50 ms. The top 15 most intense precursor ions were selected and isolated with an isolation width of 0.4 m/z and dynamic exclusion set to 20 s. Selected ions were HCD (higher-energy collisional dissociation) fragmented at normalized collision energy (NCE) 29 after accumulating to target value 1E5 with a maximum injection time of 350 ms. MS/MS acquisition was performed at a resolution of 35,000.

Raw mass spectral data files were processed via Proteome Discoverer version 2.2 (Thermo Fisher Scientific) and referenced against the Rat SwissProt database using Mascot version 2.4 (Matrix Science). Mascot is a probability-based algorithm that assesses the probability of an MS/MS spectrum matching to a given peptide from a database (41). MS/MS spectra were matched with an initial mass tolerance of 10 parts per million on precursor masses and 20 mmu (milli mass units) for fragment ions. Peptide spectrum matches for global proteomics data were filtered by Mascot score (≥30), and peptide assignments were confirmed by manual validation.

Collection and analysis for microdialysis nanopump comparison

Stock solutions of bovine hemoglobin (10 mg/15 ml; MilliporeSigma), MBP (2.87 mg/15 ml; MilliporeSigma), and 10 pmol of substance P (Abcam) were made up in DI water. Each was sampled using either nanopump or microdialysis. For microdialysis, a 20-kDa cutoff CMA 12 probe (Harvard Apparatus) was used. DI water was perfused at a rate of 1 μl/min into aliquots of hemoglobin, MBP, or substance P. Dialysate was collected in 30-min fractions into polypropylene vials. For nanopump samples, DI water was infused into stock solution for 10 min at a rate of 100 nl/min and withdrawn at a rate of 60 nl/min for 20 min into polypropylene vials.

Hemoglobin and MBP samples were analyzed via a NanoDrop Spectrophotometer ND-1000. The absorbance at 280 nm of either the nanopump- or microdialysis-derived samples was compared to an unsampled stock solution.

Relative concentration of substance P in either the unsampled stock solution or sampled via the nanopump or microdialysis device was analyzed by a nanospray LC-MS/MS (as previously described). Briefly, the collected samples were diluted 10-fold into a solution consisting of 0.1% acetic acid with 7 nM angiotensin as a loading control. One microliter of this final solution was loaded onto a custom analytical nano-LC column with an integrated electrospray ionization emitter tip. Peptides were eluted with 70% acetonitrile in 0.2 M acetic acid (solvent B) in a gradient going from 0 to 100% solvent B in 8 min. The MS was operated in positive ion mode with a spray voltage of 2 kV and heated capillary temperature of 250°C. MS data were obtained in data-dependent acquisition mode. Full scans (MS1) were acquired in the m/z range of 350 to 1500 at a resolution of 70,000 (at m/z 200), with AGC target 1E6 and a maximum injection time of 150 ms. The top 15 most intense precursor ions were selected and isolated with an isolation width of 0.4 m/z and dynamic exclusion set to 10 s. Selected ions were HCD fragmented at NCE 28 after accumulating to target value 1E5, with a maximum injection time of 150 ms. MS/MS acquisition was performed at a resolution of 35,000.

Acknowledgments: We thank T. Tamir, H. N. Schwerdt, K. Ramadi, G. Ekchian, T. Hua, H. Montague-Alamin, and M. Fahmi for technical discussions and help with this study. Funding: This work was supported, in part, by the NIH (National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering grant R01 EB016101 to M.J.Ci., R.L., and A.M.G. and R01 EB027717-01A1 to M.J.Ci., R.L., and F.M.W.), the Center for Precision Cancer Medicine at MIT, and the Koch Institute Support (core) grant P30-CA14051 from the National Cancer Institute. R.R. was funded by the AAAS L’Oréal USA For Women in Science Fellowship and the NASEM Ford Foundation Fellowship. E.R. was funded by a NSF Graduate Research Fellowship (grant 2016220817). M.J.Co. was funded by a NSF Graduate Research Fellowship (grant 1122374). A.M.G. was funded by the NIH (National Institute of Mental Health grant R01 MH060379) and the Saks Kavanaugh Foundation. Author contributions: R.R., E.B.R., A.M.G., F.M.W., R.L., and M.J.Ci. designed the study. R.R., E.R., M.W., A.T., M.J.Co., J.K., A.A.L., and E.Z. performed experiments and helped write the Methods. R.R. and E.B.R. generated the manuscript and figures. All authors participated in manuscript and figure editing. Competing interests: M.J.Ci., R.L., and R.R. are inventors on a patent application related to this work filed by the Massachusetts Institute of Technology (no. 16/411,907; filed 14 November 2019). For a list of entities with which R.L. is involved, compensated or uncompensated, see: www.dropbox.com/s/yc3xqb5s8s94v7x/Rev%20Langer%20COI.pdf?dl=0. The other authors declare that they have no competing interests. Data and materials availability: All data needed to evaluate the conclusions in the paper are present in the paper and/or the Supplementary Materials. Additional data related to this paper may be requested from the authors.

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